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文档内容摘要
ppt 植物组织培养,陈 勇,一、培养基的成分及作用 二、培养基的制备,,概念:本世纪初开始,以植物生理学为基础发展起来的一项技术。即应用无菌操作方法,培养植物的一个离体器官、组织或细胞。 这项技术已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢产物生产和种质资源的保存等方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。,,,根芽形成的激素控制理论: 细胞分裂素与生长素的比例与绝对含量,调控着植物组织的形态发生及细胞分化,当比值高时产生芽,低时产生根,比值适中时可能维持原组织生长而不分化。,植物组织培养的优点,1. 研究材料来源单一,无性系遗传背景一致 2 . 经济方便效率高 3 . 条件可控误差小 4. 生长快周期短重复性强 5 . 周年试验或生产,组织培养的几道主要工序: 培养器皿的清洗;培养基的配置、分装、包扎和高压灭菌;无菌操作——材料的表面灭菌和接种;放入培养室培养;试管苗的种植与初期管理。,,,操作技术 1. 洗涤 培养过程中最经常最大量的工作之一,是洗涤培养瓶及其它常用器皿。 最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂。 2. 灭菌 有菌的范畴: 凡是暴露在空气中的物体,曾经接触过自然水源的物体,至少它的表面,毫无例外都是有菌的。 无菌的范畴: 经过高温灼烧或蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学灭菌方法处理过后的物体,是无菌的。,,常用的灭菌方法可分为物理方法和化学方法两大类。 (1)培养基的灭菌: 常规方法是放入高压灭菌锅内加热加压灭菌。一般少量的液体只要121℃ 即每平方厘米1.1kg的压力20分钟就能达到彻底灭菌。 灭菌的功效主要是靠温度,而不是压力。 高压灭菌锅的使用可选用以下任一种: A .打开放气阀,煮沸15分钟后再关闭; B 打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出再关闭; C 先关闭放气阀,待压力上升到0.5kg/cm2 以上时,打开放气阀放出空气,再关闭。,,(2)不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。 过滤灭菌的原理:溶液通过滤膜后,细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。 (3)玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 即利用烘箱加热到160-180℃ 的温度来杀灭微生物。 (4)用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 (5)布制品采用高压灭菌 (6)其它,二、培养基的成分及作用,完善的培养基配方: 包括大量元素、微量元素、铁盐溶液、碳源、有机附加成分、植物激素、琼脂等。 配置中注意8个字: 大、微、铁、有、糖、琼、激、PH。,,(一)大量元素 植物所需元素,浓度大于0.5mmol/l的应属于大量元素,而小于0.5mmol/l的则属于微量元素。 植物必需的元素在体内的生理作用有四方面(P49)。 MS培养基的特点:含有很高量的氮、钾,尤其硝酸盐的用量很大,还含有一定数量的铵盐。,,(二)微量元素 植物所需的微量元素至少包括铁、硼、锰、锌、钼、铜、钴和氯。 微量元素的生理作用主要在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。,,(三)铁盐 现在培养基中几乎都采用Fe·EDTA形态的铁盐。 铁促进细胞分裂与伸长,还影响到叶绿体的结构组成与叶绿素形成。,,(四)有机成分 植物组织需要的一些维生素、氨基酸、肌醇,统称为有机附加成分。 维生素有维生素B1(硫胺素)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B3或维生素PP(烟酸)、维生素B5(泛酸钙)等 氨基酸中最常用的是甘氨酸。,,(五)糖 作用:碳源、碳骨架、提供底物与能源、维持一定的渗透势。 常用的碳源是蔗糖,浓度为2—5%。 (六)琼脂 琼脂是最好的固化剂,本身并不提供任何营养。 用量一般在4-10g/l之间。,,(七)植物激素 植物激素是植物新陈代谢中产生的 天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动。 常用种类有: 1. 生长素类:生理作用(P61),主要有吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-D等。,,脱分化:使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特性,回复到未分化的幼龄状态,恢复细胞分裂的能力。 分化阶段:使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组织,再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构的特化细胞。,,2 细胞分裂素 生理作用:(P63) 种类有苄基腺嘌呤(6-BA)、糠基腺嘌(激动素)等。 3 赤霉素(GA) 生理作用: (P67) 4 脱落酸(ABA) 生理作用: (P68) 5 乙烯 生理作用: (P69),,(八)PH 值 PH值即酸碱度 培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境,一般用1N的KOH或NaOH调整到PH5.6-5.8的范围内。,,(九)其它成分 较常见的有活性炭、抗生素、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂、促进细胞分裂和胚状体同步发生的药剂等。,植物组织培养Ⅰ——培养基的制备,(一)储备液的配置与保存 将配方中的药品一次称量供一段时间使用,即配一些浓溶液,用时稀释,这种浓溶液就是储备液或母液。 一般大量元素比使用液浓度高10-100倍,微量元素等可高200-1000倍。,表4-1 MS培养基储备液的配制,培养基的配制,1. 先在洁净的不锈钢锅里放入约750ml 蒸馏水,加入所需要的琼脂(8-10克)和糖(30克)。 2. 加入各种母液(如大量元素100ml,微量元素、有机物、铁盐各10ml),按需要加入植物激素(如2.4-D 20ml、6-BA 5ml)。 3. 加蒸馏水将最终体积调整到1l。,,4. 充分混合好以后,用1NKOH(或NaOH)调整PH值到所需值(5.8左右)。 5. 趁热将培养基倒入三角烧瓶中,可通过玻棒引流。 6. 包牛皮纸盖并用橡皮筋绑好。 7. 高压灭菌后取出。,,培养基的灭菌: 打开放气阀煮沸至大量热蒸汽喷出,5分钟后再关闭放气阀,待压力上升到121度 1.1kg/cm2时,稳压20分钟。然后关闭电源,待压力降为零后,再打开放气阀。,配置1升培养基分工:,,称重: 1 琼脂 8-10克; 2 蔗糖 30克; 3 肌醇 100毫克。 母液: 1 大量元素 100ml; 2 微量元素 10ml; 3 有机物质 10ml;,配置1升培养基分工:,,4 铁盐 10ml; 5 生长素 2.4-D 20ml; 6 6-BA 2ml. 配置:75%酒精 500ml 准备:培养皿 1副/人 ; 饭盒——解剖刀柄 2把;镊子(大、小)各两把; 三角烧瓶 50 ml 4个/人; 宽口瓶(大、小)各两个 裁牛皮纸、酒精棉球,培养基的配置及灭菌实验准备用品,药品: 95%乙醇 1瓶 蔗糖 1瓶 琼脂 1瓶 大量元素(10倍母液) 1瓶 微量元素(100倍母液) 1瓶 维生素(100倍母液) 1瓶 Fe盐(100倍母液) 1瓶 Ca盐(100倍母液) 1瓶 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 1瓶,,器材: 棉花 1包 橡皮筋 1包 PH试纸(4-7) 1包 牛皮纸 1张 蒸馏水 1桶 烧杯(100ml\500ml或1000ml) 各2个 培养皿(大) 8对 三角烧瓶(50ml或100ml) 20个,,广口瓶(250ml) 1个 移液管(10ml) 3支 量筒(100ml) 1个 镊子(大、中) 各1把 解剖刀柄 1把 解剖刀片 1包 剪刀(大) 1把 加热杯(1000ml、金属、有刻度) 1个 电炉(1000瓦以上) 1个 洗瓶 1个,,植物组织培养Ⅱ——接种和培养 接种:把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上。 外植体:即接种的植物材料。 材料处理的第一步:刷洗、冲洗。 第二步:用洗衣粉水或肥皂 水浸洗并搅动。 第三步:超净台内材料的表 面灭菌,,,,要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂,确定适宜的处理时间和水洗的次数。 次氯酸钙、次氯酸钠——氯气 过氧化氢——原子态氧 升汞灭菌效果最好,去除较难,需无菌水刷洗8-10次。 95%酒精——灼烧表面 不同植物、部位、组织年龄及环境状况——灭菌时间不同,人为因素(工作人员本身):工作服、帽、口罩、酒精擦手。,物品因素,器皿和用具,培养皿:洗→热压 玻璃器皿:洗→干热(干热箱)或晾干 接种用具:用CCL4布擦→湿布擦→ 泡75%~95%酒精→烧,培养基:湿热,培养材料,外部细菌:用水冲洗→化学药剂处理 内部细菌,茎尖培养 加抗生素:青霉素、利福平,操作的空气:洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸,,污染来源,,,,,无菌操作技术,1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台,然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意:台面上的用品不要放置太多或重叠放置,以免降低灭菌效果。 3、关紫外灯、打开风机,过5-10min进入缓冲间,以75%洗手和手臂,更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。(注:没有特别情况,尽量不要下工作台),4、用70-75%的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金属器械在其火焰上灼烧,冷却待用。 注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管不能灼烧,培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,5、取流水冲洗(至少30min)过的外植体,用一定的消毒剂浸泡消毒,用无菌水冲洗3~4次,放入无菌培养皿中,置于酒精灯火焰下方,用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。,6、打开培养瓶,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊子将培养材料置于培养基上,灼烧镊子放回,灼烧瓶口,盖上瓶塞。 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。,注意(1)进行培养时,动作要准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。(2)不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 (3)为拿取方便,工作台面上的用品要有合理的布局,原则上应是右手使用的东西放置在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。(4)工作由始至终要保持一定顺序性,组织或细胞在未做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在未用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。,(5)吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。 (6)工作中不能面向操作区讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 (7)手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方,瓶口最易污染,加液时如吸管尖碰到瓶口,则应将吸管丢掉。,接种时在近火焰处打开瓶口,使瓶倾斜,以免空气中微生物落入瓶中,,正 确 错 误,整个接种操作应在近火焰处进行,且动作要迅速,正 确 错 误,接种过程中尽可能达到悬空要求,,防止操作带来的污染,正 确 错 误,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,,正 确 错 误,瓶盖朝上放,接种完毕后立即盖好瓶口,正 确 错 误,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,种子和分生组织:培养时通常将其贴放在培养基表面,而不是插到培养基内部,以免供氧不足,正 确 错 误,接种茎段:注意形态学下端插入培养基内,而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,,无菌操作 无菌操作程序: (1)刷洗:表皮冲洗 (2)消毒:75%酒精 30秒 0.1生汞 8分钟 无菌水 3次 (3)切割:烟草叶片0.5×0.5cm 4-5片/瓶 (4)接种:平放在培养基上 (5)温室培养(名字、学号),接种及培养实验准备用品,用品: 75%乙醇 1瓶 酒精棉球 1瓶 培养基 5瓶 烧杯(装升汞、酒精、蒸馏水用) 3个 饭盒 1个 培养皿 1副 废液缸 1个,接种及培养实验准备用品,用品: 无菌水 1瓶 塑料膜 5张 解剖刀片 1片 打火机 1个 手套 1副 胡萝卜直根 1段 酒精灯 1盏 广口瓶(装工业酒精) 1个,