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文档内容摘要
ppt 植物细胞转化的方法种类及特点,,植物转基因技术的一般操作过程,间接转化法: 农杆菌介导法 病毒介导法,植物基因转化技术方法,DNA直接转化法: 基因枪法 电击法 花粉管通道法 化学物质诱导法 显微注射法 脂质体法,间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法,有农杆菌介导法和病毒介导法。,间接转化法,农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法。,1.农杆菌介导法,它是通过根癌农杆菌的Ti质粒(Tumer inducing plasmid)和发根农杆菌的Ri质粒(Root inducing plasmid)上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细 胞并插入到染色体基因中。,,T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和 Ri质粒上可以插入到50kb的外源基因,因此Ti质粒和 Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。,T-DNA可以将其携带的外源基因整合到植物基 因组中,T -DNA 上较重要的是 T 区两端左右边 界各为 25bp 的重复序列。其中14bp 是中心,分 10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重 要。,T-DNA,vir基因,Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个 基因共同控制着 T -DNA 的加工和转移,它们总 称调控子。,,叶盘,,消毒,,切取,土壤农杆菌浸泡,,筛选培养基,,,,愈伤组织,,分化幼苗,优点: 技术较成熟,转化效率高 操作简单,不需要特殊仪器,培养周期短 外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞,稳 定性好,减少了共抑制等基因沉默现象。 可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中 等。,缺点: 主要转化双子叶植物。 T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入,有可能导致有益基因的插入失活。 迄今所获得的近 200种转基因植物中80%以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。,病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化 的载体系统。具体来说就是将外源基因插入到病 毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源 基因导入植物细胞的一种植物转基因方法。,2.病毒介导法,利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效 率比较高,但它的安全性受到质疑,主要用于动物 的基因转移。,直接转化法(又称DNA直接导入法),它指不依 赖于生物体将裸露的DNA直接转移到植物细胞和原 生质体中,导致细胞转化的技术,与间接转化法相比, 直接转化法不需构建载体,因此又叫无载体介导转化 法。它适用于对农杆菌侵染不敏感的植物,使用此法 的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再 生系统。,DNA直接转移法,DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿主, 可以导入生物细胞;缺点是嵌合基因整合进宿主染 色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、 电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离 子束介导法和花粉管通道法。,基因枪法 电击法 花粉管通道法 化学物质诱导法 显微注射法 脂质体法,基因枪法最早是由美国康 奈尔大学的Sanford最先提出 的。它通过高速飞行的金属颗 粒将包被其外的目的基因直接 导入到受体细胞内,最后整合 到植物基因组并得以表达从而 实现基因转化的方法。1992 年,世界首例转基因小鼠就是 通过该法获得的。,,1.基因枪法,DNA,1.2m钨弹头,,吸附,特制手枪,射击植物,,装入,,优点: 克服了受体材料的限制,不必制备原生质体。 实验操作简单易行,适合于大多数细胞或组织,具有相当广泛的应用范围,已经成为植物细胞转化最有效方法之一。 缺点: 进去的DNA片段整合效率极低,遗传稳定性差,拷贝数多,不易获得再生植株。,至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法 以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、 水稻等植物转基因中应用,并获得转基因植株。基因 枪法也可以有效地用于叶绿体的转化,还可以转移 RNA、DNA克隆等。,是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的 质膜上形成瞬时可逆性开放小孔,为外源DNA提供通 道,借此导入DNA等遗传物质,达到转化的目的。由 于质膜具有可修复性,外加电压造成的膜穿孔可在一 定的时间内自动修复,从而使细胞恢复到正常的生理 状况。,2.电击法,植物细胞,原生质体,,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,,,,1-2kV, 3-25F电击,愈伤组织,,幼苗,分化,,优点: 操作简便,可以一次转化许多原生质体,转化效 率较高,特别适于瞬间表达。 缺点: 有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。 该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基 因转化当中。,花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成的天然花粉管通道,经珠心通道,将外源DNA携带入胚囊,从而达到转化目的的一种植物转基因方法。,3.花粉管通道法,优点: 适用范围广,不依赖组织培养人工再生植株; 可直接获得转基因种子,育种时间短,在鉴定 时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快 捷; 转化速度较快,变异性状稳定较快; 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。,缺点: 转化受体受植物花期的限制,同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。 在自然田间进行操作,受环境条件的影响很大。 操作的经验性很强,需要一定的技巧。 利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。,化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特 定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、 PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法应用较多,效果较好。 PEG法是一种通过化学物质PEG处理去壁的原 生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性使原 生质体获得转化的方法。,4.化学物质诱导法,优点: PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性 好、无需昂贵的基因转化仪器,且嵌合转化体很 少产生。,缺点: 原生质体培养再生难度较大; 原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗,且由于 PEG法对原生质体活力有害,转化 率低。 应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡 椒等植物的转基因植株。,显微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为 0.5nm),在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞 或原生质体中的一种直接而完善的方法。,5.显微注射DNA,该方法是Pena等1987年首创的,在用此方法进行 基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细胞固 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进行操作。,优点: 转化率高,特别是在没有合适的DNA载体系统时 更有价值 对转移物质没有限制,可选择受体细胞的核的接 受位点 受体不用特殊的选择系统 可以控制转移的量和转移物的浓度,,缺点: 设备和技术的要求较高 要想获得转化的植株,需要注射大量的细胞或原生 质体,费时费工 对细胞有损伤,一次处理细胞数量不能太多,比 较适合大细胞操作,主要用于动物的基因转化中,脂质体是根据生物膜的结构和功能特性,人工用 脂类化合物合成的双层膜囊。 脂质体法是Dellaporta等在1981年创造的,就是将 包含外源基因的脂质体与植物原生质体融合,从而 达到转基因目的一种转化方法。,6.脂质体法,优点: 可避免DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解; 适用的植物种类广泛重复性高,包装在脂质体内的 DNA或RNA可稳定地贮藏。,缺点: 在包装DNA时必须有短时间的超声处理,会使相当 多的DNA断裂; 所用材料必使用具有全能性的原生质体作为受体 细胞; 转化效率较低。 主要用于动物的基因转化,在植物上此方法介导的 基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。,几种植物转基因方法比较,谢谢!,